Numero 7 di Lettere di Ortobiologia

INFEZIONI BIOFILM CORRELATE: PROBLEMI E STRATEGIE DI INTERVENTO

IL BIOFILM

Per molto tempo i microrganismi sono stati considerati organismi planctonici: cellule sospese e classificate secondo la tipologia della loro crescita in un mezzo di coltura ricco.
Il biofilm è una comunità strutturata di cellule e microcolonie racchiuse in una matrice organica esopolimerica (EPS) autoprodotta e adesa ad una superficie inerte o vivente.
La EPS è composta da: acqua (>97%), polisaccaridi (1-2%), proteine ed enzimi (<1-2%), DNA e RNA (<1-2%) e ioni.
La conformazione della matrice polimerica varia in seguito all’interazione con fattori estrinseci, come le proprietà chimico-fisiche dell’ambiente dove il biofilm è localizzato e fattori intrinseci, come il genotipo delle cellule che lo compongono. Infatti, è stato osservato che la struttura della matrice del biofilm cambia a seconda dello stato fisiologico delle cellule, della disponibilità di nutrienti, dell’ambiente in cui si forma e delle specie microbiche che la compongono.

Il Biofilm

La quantità di EPS varia a seconda dell’organismo e aumenta all’aumentare dell’età del biofilm.
I biofilm, dunque, non sono semplici strutture microbiche adese ad una superficie, ma rappresentano sistemi biologici con un alto grado di organizzazione dove i batteri sono strutturati e coordinati in comunità funzionali, capaci, se necessario, di cooperare nei processi metabolico-riproduttivi e infettivi. Il biofilm è un’entità dinamica. La superficie esterna cambia continuamente: aumenta di spessore, forma un gradiente chimico-fisico e prevede la morte cellulare.

La formazione del Biofilm

La formazione di un biofilm è un processo dinamico e complesso che si articola in diverse fasi: trasporto e adsorbimento, adesione alla superficie, formazione di microcolonie, produzione degli esopolimeri, maturazione del biofilm e rilascio dei batteri dal biofilm. Questo determina lo sviluppo di infezioni batteriche altamente resistenti.
Il biofilm maturo è generalmente costituito da una struttura complessa che permette la diffusione dei nutrienti. La struttura di un biofilm maturo può variare non solo in funzione delle diverse specie batteriche che lo compongono, ma anche in funzione dei differenti parametri che caratterizzano l’ambiente, primi tra tutti la disponibilità di nutrienti e la densità cellulare.
Esistono anche biofilm multispecie, chiamati di coaggregazione, originati da un processo di adesione tra batteri geneticamente distinti.

Il biofilm è necessario alle specie batteriche che colonizzano la superficie poiché la matrice garantisce la stabilità ambientale e l’acquisizione di nuove caratteristiche genetiche. Inoltre, la stabilità ambientale, permette un effetto tampone contro le variazioni di nutrienti, gli agenti antimicrobici, i fagi e gli stress ambientali.
La patogenicità dei biofilm è strettamente correlata alle sue caratteristiche strutturali e ai meccanismi che consentono il rilascio nell’ambiente delle forme sessili. Le caratteristiche strutturali dei biofilm incidono sull’instaurarsi di infezioni batteriche croniche e la tendenza delle microcolonie a distaccarsi dal biofilm in forma planctonica può produrre emboli infettivi che, attraverso i capillari, possono portare a gravi conseguenze e a infezioni acute nei tessuti circostanti.

Biofilm e resistenza antibiotica

Il biofilm è necessario poiché le cellule planctoniche sono suscettibili all’azione degli antibiotici, degli anticorpi e dei fagociti. I batteri formano il biofilm, preferibilmente su superfici inerti, così la comunità sessile diventa resistente agli attacchi. L’inefficienza dei normali trattamenti risiede proprio nella difficile penetrabilità nella matrice del biofilm degli agenti antimicrobici. La matrice agisce nei confronti degli agenti antimicrobici con due diverse modalità: resistenza alla diffusione del principio attivo e neutralizzazione parziale del principio attivo.
I meccanismi responsabili della resistenza possono essere diversi: ritardata penetrazione dell’agente antimicrobico attraverso la matrice del biofilm, alterato tasso di accrescimento dei microrganismi all’interno del biofilm, cambiamenti fisiologici dei microrganismi inclusi nel biofilm e formazione di cellule “persister”. I biofilm più vecchi, a lento sviluppo, sono sensibilmente più resistenti agli agenti antimicrobici dei biofilm di impianto più giovani, a crescita veloce.

Biofilm e resistenza antibiotica

Tolleranza VS resistenza

C’è una sostanziale differenza tra tolleranza e resistenza all’antibiotico.
Tolleranza è la capacità di sopravvivenza dei batteri nel biofilm ad elevate quantità di antibiotici.
Resistenza è l’innalzamento dei quantitativi MIC necessari e lo sviluppo di modificazioni fenotipiche indotte dallo stesso antibiotico nei batteri interni al biofilm.
La resistenza è spesso correlata a mutazioni acquisite che eliminano il bersaglio molecolare dell’antibiotico e permettono ai batteri di sopravvivere al trattamento anche se non incorporati nel biofilm.
Al contrario, la tolleranza permette alle cellule batteriche di sopravvivere ad elevate concentrazioni di antibiotico solamente se si trovano all’interno del biofilm.

Tolleranza VS resistenza

La tolleranza è garantita dall’effetto “filtro” del biofilm nei confronti dell’antibiotico. L’antibiotico può penetrare il biofilm solo dopo che lo ha saturato. In questo caso però le tempistiche di penetrazione sono così lunghe da permettere l’adattamento delle colonie batteriche. Inoltre, la concentrazione di antibiotico che arriva per via sistemica è talmente bassa che non permette la saturazione del biofilm. Un altro meccanismo che porta alla tolleranza è la diversa attività fisiologica delle colonie batteriche all’interno del biofilm, che si riduce fino ad azzerarsi muovendosi dal margine al centro del biofilm. Un metabolismo molto lento inattiva i siti bersaglio degli antibiotici, riducendone notevolmente l’effetto battericida.
Tolleranza e resistenza sono le cause del fallimento del trattamento antibiotico in presenza di biofilm.
Gli antibiotici da soli forniti per via sistemica non sono in grado di rimuovere il biofilm ed eradicare completamente l’infezione. L’approccio più efficace è la rimozione dell’impianto infetto, la pulizia chirurgica dei tessuti contaminati o infetti e la successiva terapia antibiotica sistemica a lungo termine. È necessario un approccio combinato tra chirurgia e terapia farmacologica perché le concentrazioni antibiotiche necessarie all’eradicazione del biofilm sono superiori anche di 1000 volte rispetto ai parametri di concentrazione identificati in vivo senza effetti tossici. Dunque, sono state proposte ed utilizzate soluzioni che fornissero elevate concentrazioni di antibiotico a livello topico, antimicrobici combinati o terapie sequenziali.

BIOLFILM SU DISPOSITIVI MEDICI

Vari dispositivi medici sono per conformazione e utilizzo predisposti ad ospitare biofilm proprio perché richiedono un intervento chirurgico per la loro installazione. È la chirurgia stessa infatti che, provocando danni ai tessuti, causa un accumulo di piastrine e fibrina sulle suture e sul dispositivo impiantato, che a sua volta funge da pellicola di supporto per l’impianto del biofilm.

Infezioni periprotesiche (PJI)

Le infezioni periprotesiche (PJI), soprattutto di anca e di ginocchio, rappresentano una complicanza relativamente frequente negli impianti di protesi ortopediche, con un’incidenza pari allo 0,5-2%. Le PJI sono dovute soprattutto al lungo tempo chirurgico, alla necessità di interventi successivi e alla protratta ospedalizzazione (Zannoli et al. 2019).
La gestione di una PJI è complessa, dispendiosa e richiede una lunga ospedalizzazione, la cooperazione tra varie figure professionali, almeno un ulteriore intervento di revisione e una prolungata terapia antibiotica. L’associazione di questi fattori porta ad una significativa morbilità e mortalità (De Vecchi et al. 2016; Palan et al. 2019; Deogaonkar et al. 2019; Lepri et al. 2019; Mussa et al. 2020).

I patogeni possono raggiungere la protesi dal torrente ematico, per disseminazione ematogena, per inoculazione diretta, come conseguenza dell’intervento chirurgico o attraverso la ferita chirurgica, per disseminazione esogena (Deogaonkar et al. 2019; Mussa et al. 2020).

La sintomatologia con cui si manifesta una PJI può essere variabile e include: febbre, dolore, segni locali di infiammazione, deiscenza della ferita chirurgica o fistola cutanea. Spesso sono anche presenti segni radiografici e clinici di mobilizzazione dell’impianto (osteolisi periprotesica).

I batteri tendono a crescere adesi all’impianto protesico formando il biofilm molto rapidamente e rendendo difficile sia la diagnosi che il trattamento con antibiotici (De Vecchi et al. 2016; Deogaonkar et al. 2019; Mussa et al. 2020). Anche funghi e micobatteri possono causare PJI, seppur con meno frequenza (Mussa et al. 2020). Spesso la diagnosi viene complicata dalla presenza di colture negative in pazienti con sintomatologia riconducibile ad una PJI.

La gran parte delle colture negative nelle PJI sono imputabili a trattamenti antimicrobici effettuati prima dell’analisi microbiologica, a campionamenti microbiologici inadeguati o insufficienti e a un insufficiente tempo di coltura delle piastre, troppo breve per i tempi di crescita delle colonie batteriche più sensibili (Palan et al. 2019; Mussa et al. 2020).
Circa il 46% delle infezioni culture-negative PJI (CN-PJI) sono correlate ad infezioni fungine, mentre il 43% a micobatteri (Palan et al. 2019). Non ci sono gold standard per la diagnosi di una CN-PJI ed è quindi difficile capire se sia davvero negativa o se sia un falso negativo. Ci sono due grandi gruppi di pazienti che possono avere una CN-PJI: una PJI chiaramente infetta ma con colture microbiologiche che restano negative; una potenziale PJI ma con coltura negativa e senza ovvi segnali clinici di infezione.

In quest’ultimo caso, nell’85% dei casi, è presente un’infezione di basso grado causata da un patogeno fungino o atipico, propionibatteri o micobatteri, molto difficili da coltivare e che richiedono specifiche tecniche microbiologiche per rilevarli (Palan et al. 2019).

I fattori di rischio per una CN-PJI sono simili a quelli per una PJI colture-positive, e includono: obesità, età (>65 anni), genere maschile e comorbilità (Palan et al. 2019; Deogaonkar et al. 2019). Mentre i fattori di rischio specifici per le CN-PJI includono: precedenti infezioni periprotesiche, siti chirurgici infetti, precedenti revisioni chirurgiche e precedente utilizzo di antibiotici. Da uno studio retrospettivo su 135 pazienti CN-PJI è emerso che il 64% ha fatto uso precedente di antibiotici (Palan et al. 2019).

In base ai criteri diagnostici più recenti stabiliti dalla MuscoloSkeletal Infection Society nel 2018, la diagnosi di PJI è confermata in caso di fistola comunicante con l’impianto o dell’identificazione dello stesso microrganismo da almeno due prelievi colturali. Altri elementi che aiutano a confermare la diagnosi di PJI sono: l’innalzamento degli indici di flogosi sierici (PCR e VES), di esterasi leucocitaria, di alfa-defensina sinoviale e l’aumento dei granulociti neutrofili del liquido sinoviale, nonché l’isolamento di un microrganismo in un unico campione. La scintigrafia con leucociti marcati ha un’alta specificità ed è utile soprattutto per escludere la diagnosi nei casi dubbi.

I principali fattori di rischio per sviluppare un’infezione del sito chirurgico o un’infezione periprotesica sono: precedenti interventi chirurgici, diabete mellito poco controllato, malnutrizione, obesità, malattia epatica attiva, malattia renale cronica, fumo eccessivo, consumo eccessivo di alcol, abuso di droghe per via endovenosa, recente ricovero ospedaliero, soggiorno prolungato in centro di riabilitazione, il sesso maschile, artrite post-traumatica, artropatia infiammatoria e grave immunodeficienza (Da Rin De Lorenzo 2015).

Classificazione infezioni periprotesiche – PERCORSO DIAGNOSTICO DI LABORATORIO PER LE INFEZIONI DI PROTESI ARTICOLARI E MEZZI DI OSTEOSINTESI (Caola et al. 2017)

Secondo l’aggiornamento AMCLI (2017) le PJI possono essere classificate in base al tempo di insorgenza dei sintomi dopo l’impianto.

  • PRECOCI (EARLY): i sintomi compaiono entro 4-6 settimane dall’impianto.

Queste infezioni sono spesso causate da batteri aggressivi, bacilli Gram-negativi. Vengono normalmente acquisite durante l’intervento per shedding microbico sul campo operatorio. Più raramente possono essere espressione di diffusione ematogena da focolai infettivi distali non bonificati prima dell’intervento.

Se diagnosticate precocemente (< 3 settimane) si può perseguire un approccio medico-chirurgico conservativo con debridement, eventuale rimozione delle componenti modulari protesiche e ritenzione della protesi, associato a terapia antibiotica long-term di massima performance. Tuttavia, il semplice criterio temporale non consente di formulare una prognosi adeguata, poiché il risultato del trattamento conservativo dipende anche dalla localizzazione batterica (se in un’area raggiungibile dalla pulizia chirurgica o meno).

  • RITARDATE (DELAYED): la comparsa dei sintomi avviene dopo 4-6 settimane ma entro 2 anni dall’impianto.

Queste infezioni sono spesso causate da acquisizione esogena per shedding microbico sul campo operatorio. I microrganismi sono a bassa-media patogenicità o da microrganismi ad elevata patogenicità con bassa carica infettante.

In tali infezioni il biofilm è ben strutturato, dunque l’approccio medico-chirurgico è non conservativo. Viene programmata la rimozione dell’artroprotesi con il posizionamento di uno spaziatore (antibiotato o meno), effettuata la terapia antibiotica di massima performance e, una volta accertata l’eradicazione dell’infezione, viene riposizionata l’artroprotesi. Le linee guida IDSA indicano un tempo medio di 4-6 settimane per la terapia antibiotica, anche se le tempistiche dovrebbero essere guidate dall’andamento della PCR, con sospensione correlata alla negativizzazione stabile di tale parametro. L’intervento di riposizionamento dovrebbe essere considerato “pulito”, senza necessità di somministrazione di antibiotico se non per la profilassi short-term.

  • TARDIVE (LATE): la comparsa della sintomatologia avviene dopo 2 anni dall’impianto protesico. Queste infezioni sono causate da patogenesi ematogena dalla migrazione del microrganismo da un focus infettivo a distanza. Per tali infezioni dovrebbe emergere il concetto di early diagnosis in relazione alla durata dei sintomi: una diagnosi precoce, entro 3 settimane dall’insorgenza del quadro clinico, presupporrebbe un biofilm ancora non del tutto strutturato e quindi consentirebbe ancora un approccio di tipo conservativo analogo a quello perseguibile per le forme early.

Trattamento chirurgico

Qualunque sia il concetto di “early” a cui si fa riferimento (per timing rispetto all’intervento – early infection – o rispetto all’insorgenza dei sintomi -early diagnosis-) il debridement costituisce un’emergenza chirurgica da eseguire il prima possibile, nell’intento di agire contro un biofilm non ancora organizzato.

Nel caso di un’infezione precoce (early) è possibile tentare il salvataggio della protesi mediante DAIR (Debridement Antibiotics and Implant Retention).

Nelle infezioni tardive (delayed e late) è necessaria la rimozione di tutte le componenti protesiche, a causa della crescita batterica nel biofilm attorno alla protesi. Nella maggior parte dei casi il trattamento richiede un approccio in due tempi, chiamata revisione two-stage.

L’analisi di studi precedenti condotta da Zimmerli & Sendi (2019) mostra come la scelta di tipologia di trattamento chirurgico dipenda molto dalle condizioni del paziente, della ferita, delle tempistiche di insorgenza dei sintomi relativi all’infezione e alla presenza/assenza di comorbilità. Pazienti con PJI ematogena acuta o post-operatoria precoce con tessuti molli in ottime condizioni possono essere trattati con successo con antibiotico biofilm attivo, debridement e ritenzione dell’impianto (Zimmerli & Sendi, 2019; Lepri et al. 2019). Al contrario, pazienti che non presentano tali requisiti vanno trattati con approccio two-stage. La selezione dei pazienti per l’una o l’altra metodica è fondamentale per ottenere un successo nel trattamento. Si è visto che applicare il metodo sbagliato inizialmente significa compromettere decisamente le percentuali di successo future con ulteriori trattamenti chirurgici. In pratica, sottoporre a procedura DAIR un paziente non idoneo significa compromettere le possibilità di successo anche se successivamente si applica la metodica two-stage (Zimmerli & Sendi, 2019; Lepri et al. 2019).

Essendo la metodica two-stage maggiormente invasiva e rischiosa, soprattutto se applicata a pazienti in età avanzata, diventa imprescindibile una corretta analisi microbiologica per l’identificazione sicura del o dei patogeni in modo tale da assicurare la terapia antimicrobica ideale all’eradicazione dell’infezione prima del secondo reimpianto.

Per l’identificazione del microrganismo coinvolto sono necessari esami colturali sia sui tessuti periprotesici che sulle protesi, mediante sonicazione o ditiotreitolo. Successivamente, la terapia antibiotica verrà impostata dall’infettivologo sulla base dei risultati dell’antibiogramma.

Il successo di trattamento prevede l’eradicazione dell’infezione con una ferita completamente guarita, mancanza di recidiva, nessun intervento chirurgico successivo per infezione dopo il reimpianto e nessun evento di mortalità correlata alla PJI fino a due anni dopo l’intervento chirurgico PJI definitivo.

Infezioni dopo la fissazione della frattura (IAFF)

Una delle complicazioni più temute e impegnative nel trattamento dei pazienti con trauma muscoloscheletrico è l’infezione dopo la fissazione delle fratture (IAFF). Una IAFF può invalidare il processo di guarigione, favorendo una perdita permanente di funzionalità o addirittura terminare con l’amputazione dell’arto o della parte imputata. Il trattamento di IAFF è decisamente oneroso sia dal punto di vista economico, sia dal punto di vista del costo sociale poiché implica un ricovero molto lungo del paziente e possibili gravi danni permanenti (Metsemakers et al. 2016; Morgenstern et al. 2018)

Le fratture esposte degli arti sono spesso associate a un notevole danno osseo, con stripping periostale e tissutale con conseguente grave contaminazione. In queste condizioni i batteri violano facilmente la barriera cutanea danneggiata e aderiscono alle superfici di impianti e frammenti ossei, stabilendo un’infezione frattura-correlata (Morgenstern et al. 2018). Le infezioni frattura-correlate possono occupare fino al 30% delle fratture esposte complesse.

I dati raccolti da studi degli anni ‘80-’90 indicano che i tassi di infezione dopo la sintesi operatoria di fratture chiuse a bassa energia sono pari all’1%, mentre possono anche superare il 30% nel caso di fratture esposte complesse. Ad oggi i tassi sembrano essersi ridotti, ma l’assenza di una standardizzazione nei protocolli di trattamento in urgenza, in programmazione chirurgica e di una profilassi, fanno in modo che la IAFF sia ancora un problema piuttosto presente (Metsemakers et al. 2016).

Se dal punto di vista clinico la PJI può essere paragonata alla IAFF, ci sono notevoli differenze sia in termini di rischio di infezione durante la prima chirurgia, sia nelle opzioni di trattamento. Infatti, i pazienti fratturati spesso presentano tessuti molli in condizioni critiche o danni al sistema vascolare. Questo compromette l’accesso ai meccanismi difensivi del paziente e l’arrivo degli antibiotici in loco. Le ferite cutanee da frattura esposta sono spesso contaminate da una non nota varietà e abbondanza di contaminanti batterici che non sono normalmente presenti durante un intervento di artroplastica primaria. Inoltre, questi pazienti spesso hanno necessità di visite ripetute prima della fissazione definitiva, di un “second look” o di un lembo cutaneo ricostruito mediante chirurgia plastica; tutti interventi non routinari nell’artroplastica (Metsemakers et al. 2016).

Classificazione infezioni IAFF

Le infezioni dei mezzi di osteosintesi possono essere classificate in base al tempo di insorgenza dei sintomi dopo l’intervento chirurgico in (Caola et al. 2017).

  • PRECOCI (EARLY): tempo di insorgenza della sintomatologia < 2 settimane.

Vengono acquisite prevalentemente durante il trauma o l’intervento chirurgico. Sono causate da microrganismi ad alta virulenza.

  • RITARDATE (DELAYED): tempo di insorgenza della sintomatologia tra le 2 e le 10 settimane.

Vengono acquisite durante il trauma o l’intervento chirurgico e sono causate prevalentemente da microrganismi a bassa virulenza.

  • TARDIVE (LATE): tempo di insorgenza della sintomatologia > 10 settimane.

Vengono acquisite durante il trauma o l’intervento chirurgico e sono causate di solito da microrganismi a bassa virulenza. Possono essere causate occasionalmente da disseminazione ematogena da siti di infezione remoti.

STRATEGIE PREVENTIVE E DI INTERVENTO

Le strategie di intervento preventivo sono volte ad impedire la contaminazione iniziale del dispositivo, mediante materiali specifici del dispositivo stesso, coperture in gel anti-biofilm o terapie antibiotiche sistemiche volte a scongiurare l’adesione batterica. Qualora non si riuscisse, le azioni successive sono volte a: minimizzare la concentrazione microbica iniziale sul dispositivo, attraversare la matrice del biofilm per colpire le cellule biofilm associate, sostituire i dispositivi infetti e ricercare biomateriali a rilascio locale di agenti antimicrobici (Zimmerli & Sendi 2019).

La rifampicina è considerata il miglior farmaco nel trattamento di PJI causate da stafilococchi, grazie alle sue proprietà contro il biofilm e grazie alla sua farmacocinetica (Mussa et al. 2020). Molti studi clinici hanno infatti dimostrato un migliore outcome in pazienti trattati con rifampicina. Per minimizzare il rischio di sviluppo di resistenze è utile combinare la rifampicina anche con un altro antibiotico, come dimostrato da Mussa et al. (2020).

Secondo gli studi condotti da Zimmerli & Sendi (2019), la terapia antibiotica sistemica combinata con rifampicina deve essere riservata a pazienti gestiti con DAIR a causa degli effetti collaterali che questa terapia può causare nel lungo periodo e per prevenire lo sviluppo di resistenze (Zimmerli & Sendi, 2019).

Ultimamente, in addizione alla terapia antibiotica sistemica, ha acquisito importanza l’utilizzo di carrier per il rilascio locale controllato di antibiotici. Questa metodica può essere utilizzata unicamente in caso di chirurgia two-stage e permette di eradicare l’infezione a livello locale prima del reimpianto protesico o della sintesi, limitando il quantitativo di antibiotici per via sistemica.

In caso di infezione o sospetto di infezione in presenza di dispositivi protesici, mezzi di sintesi, fissazione esterna o altri impianti è fondamentale l’identificazione microbiologica del patogeno per una mirata e corretta azione antimicrobica. Solo in questo modo i Medici competenti possono studiare una terapia farmacologica mirata e un piano chirurgico eventuale avente l’obiettivo di eradicare l’infezione nel minor tempo possibile e con la minore invasività possibile.

METODI DI INDAGINE MICROBIOLOGICA: SONICAZIONE e DITIOTREITOLO (DTT)

Considerata la complessità delle tipologie di infezione che nell’ambito ortopedico riguardano la protesica, i mezzi di sintesi e l’apparato osteoarticolare, sono diversi gli aspetti critici associati alla loro diagnosi di laboratorio. In particolare, la fase preanalitica e i percorsi che seguono i campioni biologici, incluse le informazioni clinico-anamnestiche del paziente, possono portare a una diagnosi errata e ad un inappropriato approccio terapeutico. Il che si traduce in un aumento dei costi a carico del sistema sanitario (Caola et al. 2017; Linea Guida SIOT 2019).

La diagnosi di un’infezione periprotesica può essere effettuata mediante: esami clinici, esami sierologici, esami del liquido sinoviale, esami radiologici e tecniche di imaging, esami istologici intra-operatori ed esami microbiologici (Linea Guida SIOT 2019). Ognuno di questi metodi ha una raccomandazione più o meno forte secondo la Linea Guida SIOT del 2019. In particolare, le principali criticità riscontrate riguardano: la sensibilità e specificità degli esami sierologici, il numero di campioni prelevati, la modalità di prelievo e la tipologia di materiale analizzato per quanto riguarda gli esami istologici intra-operatori. Vengono ritenuti più affidabili i prelievi colturali per esami microbiologici (Linea Guida SIOT 2019). Solitamente sono necessari almeno 3-6 campioni di tessuto periprotesico per raggiungere l’isolamento del patogeno con certezza. I campioni devono essere prelevati nelle sedi di infezione corrette e con accortezza per evitare la contaminazione. È stato dimostrato che la contaminazione dei campioni porta al 3-52% di falsi positivi. La principale fonte di contaminazione è la sala operatoria e in particolare deriva dall’appoggio del materiale espiantato su diverse superfici -anche se sterili- prima del posizionamento definitivo nel contenitore di raccolta. Inoltre, è stato dimostrato che la coltura di materiale espiantato è decisamente più affidabile nell’isolamento del patogeno rispetto all’analisi effettuata sui tamponi (Caola et al. 2017; Drago et al. 2019; Linea Guida SIOT 2019).

I campioni bioptici, le componenti protesiche, il cemento di fissazione, i mezzi di osteosintesi, fili e sostituti ossei sono materiali adatti per la coltura e l’isolamento di batteri organizzati in biofilm (Caola et al. 2017; Linea Guida SIOT 2019). Allo scopo di prevenire la contaminazione dei materiali espiantati tutti i materiali devono essere prelevati con strumentario sterile non utilizzato in fasi precedenti, non deve essere messo in contatto con la cute o con la teleria del campo operatorio e deve essere posizionato immediatamente nel contenitore sterile per l’analisi, che viene subito chiuso ermeticamente. È preferibile che il contenitore sia strutturato in modo da evitare ulteriori manipolazioni del campione (Caola et al. 2017; Drago et al. 2019).

La diagnosi microbiologica è stata migliorata notevolmente con l’introduzione della sonicazione, un metodo per la disgregazione fisica del biofilm (Karbysheva et al. 2020). Recentemente, sono stati studiati agenti chimici per il distacco del biofilm come l’agente chelante etilendiamminotetraacetico (EDTA) e l’agente riducente ditiotreitolo (DTT) (Karbysheva et al. 2020). Inoltre, nello studio di Mussa et al. (2020) è stato osservato come la redazione di un protocollo sistematico per la raccolta dei campioni microbiologici e l’utilizzo della sonicazione abbiano contribuito significativamente alla diminuzione di colture negative in presenza di un’infezione. Anche l’utilizzo del DTT sui campioni espiantati aumenta sensibilmente la capacità di indagine microbiologica, riducendo le colture negative in presenza di infezione (Mussa et al. 2020). Secondo Sambri et al. (2017) e Mussa et al. (2020) i risultati ottenuti con sonicazione e DTT sono comparabili e aumentano la capacità di diagnosi microbiologica.

SONICAZIONE

Il gold standard per l’indagine microbiologica è il prelievo sterile di 5/6 campioni di tessuto provenienti dai vari piani chirurgici, che poi verranno utilizzati per esami microbiologici e istologici. Spesso ai campioni bioptici vengono associati prelievi di liquido sinoviale e tamponi (Yan et al. 2018; Linee Guida SIOT 2019). Il tasso di falsi negativi che vengono ottenuti è molto alto, tra il 17 e il 53%, rendendosi necessari metodi per la disgregazione del biofilm (Palan et al. 2019; Baldan & Sendi 2020).
La sonicazione, disgregando il biofilm, aiuta ad aumentare il numero di cellule batteriche disponibili per la coltura ed è una metodica meno sensibile a terapie antimicrobiche effettuate prima dell’intervento (Yan et al. 2018; Palan et al. 2019; Baldan & Sendi 2020).
La sensibilità della sonicazione si attesta tra il 60% e il 97% e la specificità tra il 90% e 99%. In particolare, rispetto alle colture di tessuti periprotesici, la sonicazione ha una sensibilità significativamente superiore (92.5% VS 66.7%). Inoltre, la sonicazione permette di rilevare con maggior accuratezza e sicurezza i patogeni Gram-positivi, grazie ad un miglior recupero degli stafilococchi coagulasi-negativi (Sebastian et al. 2018; Palan et al. 2019).
Tuttavia, a causa del tempo necessario e del costo del macchinario e strumentario, la sonicazione non è usata spesso, però nei casi di CN-PJI può aumentare le possibilità di individuazione del patogeno (Palan et al. 2019).

DITIOTREITOLO (DTT)

Il ditiotreitolo (DTT) è un composto chimico riducente che viene utilizzato spesso in campo biologico e di laboratorio, data la sua capacità di rompere i legami tra proteine e composti organici, anche a temperatura ambiente. Inizialmente è stato utilizzato nei laboratori di microbiologia per la fluidificazione dei campioni provenienti dalle vie respiratorie, per l’isolamento del patogeno presente (Lepri et al. 2019). In seguito, è stato scoperto che l’azione riducente si verifica anche nei confronti del biofilm batterico, rendendo il DTT ideale per il distaccamento dei batteri dal biofilm formatosi su materiali protesici, mezzi di sintesi o vari dispositivi medici impiantabili (Drago et al. 2012; Caola et al. 2017; Lepri et al. 2019; Palan et al.

2019; Sebastian et al. 2021). La sensibilità del DTT si attesta circa all’85.7%, mentre la specificità si attesta circa al 94.1% (Palan et al. 2019).

L’isolamento e l’identificazione dell’agente patogeno è il metodo più sicuro per la diagnosi di laboratorio e rappresenta il criterio principale per la diagnosi delle infezioni periprotesiche, soprattutto se cronicizzate (Drago 2018).

La rimozione dei microrganismi dal biofilm prima della coltura migliora la sensibilità della diagnosi microbiologica. Solitamente il gold standard è rappresentato dalla sonicazione, insieme alle colture tissutali. Tuttavia, la sonicazione è limitata dalla strumentazione, che non è disponibile in tutti i laboratori e dalla necessità di personale specializzato e dedicato al suo utilizzo. Inoltre, la metodica di analisi prevede vari passaggi che potrebbero aumentare il rischio di contaminazione dei campioni (Drago 2018). Il DTT costituisce una valida alternativa alla sonicazione, avendo specificità e sensibilità paragonabili (De Vecchi et al. 2016; Drago et al. 2013; Drago 2018; Sambri et al. 2018). Il DTT è di semplice utilizzo, non richiede personale specializzato e dedicato e permette di disgregare il biofilm senza manipolare i campioni raccolti, riducendo al minimo le possibilità di contaminazione.

RILEVA

RILEVA è un dispositivo medico-diagnostico in vitro (IVD) appositamente studiato per la raccolta e l’indagine microbiologica di dispositivi medici espiantati in sala operatoria perché infetti o sospetti tali.

RILEVA è stato studiato per coniugare un sistema di raccolta sterile, da utilizzare in sala operatoria con il DTT, un efficace metodo per la disgregazione del biofilm.

Lo scopo principale è infatti quello di evitare manipolazioni dei campioni successive alla raccolta, in modo tale da minimizzare le possibili contaminazioni e garantire la disgregazione del biofilm, così da ottenere una maggior accuratezza e precisione nell’identificazione del patogeno.

RILEVA infatti si compone di una sacca+clamp per la raccolta e la chiusura ermetica in campo sterile dei campioni da analizzare e di tutto il materiale necessario alla processazione della sacca con DTT in laboratorio di microbiologia.

La sacca consente la raccolta di qualsiasi dispositivo protesico, dai chiodi endomidollari, ai mezzi di sintesi, alle protesi e ai componenti di fissatori esterni in campo ortopedico, fino alle protesi mammarie, valvole cardiache, shunt neurochirurgici…e tutti i dispositivi e tessuti perimplantari solidi espiantabili con tecnica sterile. È inoltre dotata di due port con attacco luer-lock: un port “IN” e un port “OUT” dotato di filtro, in modo tale che la soluzione di ditiotreitolo possa essere inserita e prelevata agevolmente, senza aprire la sacca.

Per quanto riguarda la parte dedicata alla processazione della sacca in laboratorio di microbiologia RILEVA contiene tutto il materiale necessario alla ricostituzione della soluzione di ditiotreitolo, al suo trasferimento nella sacca, al suo prelievo dalla sacca e alla sua centrifugazione nelle falcon per ottenere il pellet batterico da seminare sulle piastre di coltura. Tutti i passaggi della processazione in laboratorio vengono svolti necessariamente sotto cappa a flusso laminare, così da evitare le contaminazioni dei campioni.

La soluzione di DTT utilizzata per la disgregazione del biofilm ha una concentrazione dello 0.1% m/v, come indicato dal protocollo AMCLI aggiornato al 2017.

Con RILEVA è possibile anche effettuare l’emocoltura prima che la soluzione venga trasferita nelle falcon per la centrifugazione. Dopo la centrifugazione verrà eliminato il surnatante e il pellet depositato sul fondo sarà seminato su piastre di coltura.

RILEVA è un sistema sicuro, rapido ed efficace, studiato appositamente per standardizzare sia il metodo di raccolta dei campioni in sala operatoria, sia la metodica di processazione in laboratorio di microbiologia, permettendo di aumentare la riproducibilità, l’affidabilità e la precisione dei risultati. Utilizzando il DTT e un’apposita metodologia di raccolta si minimizzano le possibili contaminazioni e si massimizza la capacità di disgregazione del biofilm per l’ottenimento di una corretta identificazione microbiologica.

RILEVA

RILEVA in quanto dispositivo IVD monouso non necessita di ulteriori attrezzature, se non quelle già presenti in ogni laboratorio di microbiologia per le normali procedure di indagine microbiologica, né di personale specializzato.

È sufficiente una formazione iniziale agli utilizzatori del dispositivo, effettuata dall’azienda stessa.

RILEVA deve essere conservato in frigo ad una temperatura 2-8°C per la presenza del DTT.

RILEVA è fabbricato e distribuito da Joint Srl ed è un IVD regolarmente registrato al Ministero della Salute.

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